Comme les êtres humains, les bactéries sont susceptibles d’être infecté par
des virus : ces virus sont des bactériophages. Afin de faire face à ces
pathogènes, la bactérie possède un système de défense bien particulier. L’étude
de ce dernier a commencé il y a une trentaine d’année, lorsque des chercheurs
japonais, Atsuo Nakata et son équipe de l'université d'Osaka, ont découvert de
petites séquences d’ADN répétées dans les cellules bactériennes. Ces séquences
palindromiques possèdent entre elles des séquences intermédiaires de même
taille appelées CRISPR (acronyme anglais pour « courtes répétitions en
palindrome regroupées et régulièrement espacées »). L’importance de ces
séquences n’a été démontré que vingt-ans plus tard. En effet, les séquences
CRISPR correspondent à des séquences d’ADN provenant de bactériophages, et
correspondent à des ADN cibles. Ces fragments d’ADN une fois transcrits en ARN guides,
vont amener telle « la tête chercheuse d’un missile » les enzymes Cas
(des endonucléases pouvant couper de l’ADN) vers l’ADN cible du virus. En effet,
l’ARN synthétisé par la bactérie provenant de l’ADN du virus, il peut donc
s’appareiller avec la séquence qui lui est complémentaire dans le génome du
virus. Une fois l’appariement fait, l’enzyme Cas9 sectionnera les deux brins de
part et d’autre de l’ARN guide rendant alors inactif l’ADN du virus. Ce
processus constitue la mémoire du système immunitaire de la bactérie.
Titre : Mode opératoire du système CRISPR/Cas9
En 2012, deux chercheuses : Jennifer DOUDNA et Emmanuelle CHARPENTIER [1],
transforment ce mécanisme de défense en un outil d’application de la biologie
moléculaire. Il s’agit du système CRISPR/Cas9. Cette technique consiste à
synthétiser un ARN guide in vitro
qu’on couple à l’endonucléase Cas9. L’ARN guide permettra d’atteindre une
séquence d’ADN voulu dans une cellule. Ainsi si l’on introduit ces éléments
dans une cellule, l’ARN permettra de guider l’enzyme Cas9 vers la séquence
cible de l’ADN pour la couper. Pour simplifier, ce système permet donc de
réaliser une « chirurgie du génome ». De plus, l’utilisation de ce
système pourrait permettre de mettre en évidence de nombreuses fonctions qui en
feront, selon de nombreux scientifiques, un outil d’avenir de la génétique.
Nous traiterons tout d’abord des applications dans lesquelles le système
CRISPR/Cas9 peut être d’un grand recours, notamment à des fins thérapeutiques
mais aussi en recherche fondamentale. Enfin, bien que ce système puisse
s’avérer crucial pour étudier le génome sous un nouvel angle, il n’en garde pas
moins des failles. De ce fait, nous évoquerons les limites d’une part technique
de ce système et d’autre part éthique.
Application en recherche fondamentale
Dans un premier temps, la technique CRISPR/Cas9 a
rapidement intégrée le domaine de la recherche fondamentale. En effet, celle-ci
permet de mieux comprendre le rôle de gènes bien distincts. On peut aisément mettre
en évidence le rôle des gènes en comparant l'activité d'une cellule modifiée
(en y retirant un gène connu) avec celle d'une cellule de la même lignée mais
n’ayant pas été modifiée. C’est justement ce qui a été appliquée sur la levure Candida albicans afin de déterminer les gènes
responsables d’infections fongiques essentiellement au niveau des muqueuses
digestives et génitales chez l’Homme. Alors qu’auparavant les modifications du
génome d’un organisme se faisaient grâce à des méthodes complexes, longues et
parfois très coûteuses, aujourd’hui la technique CRISPR/Cas9 a facilité cette
tâche. L'endonucléase Cas9 couplée aux séquences CRISPR qui contiennent l’ARN
guide est devenu un outil indispensable à la mutagenèse dirigée sur des gènes
bien particuliers dans les systèmes eucaryotes et procaryotes. En effet, le
système CRISPR/Cas 9 peut intervenir dans n’importe quel type cellulaire. Des
éliminations, insertions ou substitutions de gènes sont possibles et peuvent
entraîner des décalages du cadre de lecture de la séquence d’ADN étudiée ou des
arrêts prématurés provoquant le dysfonctionnement définitif des gènes cibles.
Par ailleurs, cette découverte a offert
la possibilité de modifier génétiquement des plantes dans l’agronomie pour
fabriquer des « organismes génétiquement modifiés » tels que le riz, le
blé ou encore le sorgho. Contrairement aux cellules animales, les plantes
possèdent plusieurs copies d’un même gène. En 2014, une équipe chinoise [2] de l’académie des sciences de Pékin a
utilisé l’outil CRISPR/Cas9 pour cibler des gènes multicopies chez une espèce
de blé. Ils ont ainsi réussi à inactiver ces gènes multicopies. Ces gènes étant
susceptibles de provoquer des pathologies, leur mutation limite alors l’usage de
pesticides ou de fongicides sur ces plantes. Le CRISPR/Cas9 a également enrichi
le domaine de l’agroalimentaire, notamment dans l’industrie laitière. En effet,
la fabrication de yaourts et fromages nécessitent des microorganismes nommés Lactobactéries qui sont sensibles aux
infections par des bactériophages. On a donc introduit dans leur génome un brin
d’ADN « viral » via
CRISPR/Cas9 afin d’obtenir des souches résistantes.
En outre, la souplesse du système CRISPR/Cas9 a conduit au développement de
nombreuses applications d'ingénierie du génome dont la plupart ont été appliquées
avec succès dans les systèmes de culture cellulaire, ce qui facilite les
recherches sur des maladies génétiques complexes.
Titre : Quelques
applications de la technique CRISPR Cas9.
(Modifiée à partir de www.samw.ch/dms/fr/Publications/Bulletins/15-4_SAMWbulletin_F.pdf )
Application en thérapie génique
La technique CRISPR/Cas9 a également des applications
en thérapie génique. Cette innovation biotechnologique est susceptible de
pouvoir guérir des maladies génétiques
causées par des gènes défectueux. Elle peut cibler plus précisément les gènes
déficients et les remplacer par un allèle sauvage ou les éliminer.
Cet outil fut tout d’abord testé en
2014 sur des primates et plus précisément sur des macaques asiatiques. Une
équipe chinoise de l'université médicale de Nanjing, dirigée par le
biologiste JiahoSha [4] a réussi
à faire agir le système CRISPR/Cas 9 sur 2 gènes d’une séquence d’ADN d’embryon
de macaques, parmi les 3 ciblés. Ces embryons ont été ensuite introduits dans
des femelles porteuses. Des jumeaux
ayant hérité de 2 gènes modifiés par l’outil ont été obtenus. Ainsi l’application
du CRISPR/Cas9 fut un succès et révèle, surtout, que cette technique pourrait
être utilisée sur des cellules humaines.
Titre :Modification
simultanée de deux gènes chez le macaque crabier
Les premières
maladies génétiques humaines ciblées par cette technique sont les maladies du
sang et du foie qui sont facilement accessibles et possèdent tous les deux des types cellulaires limitées (les hépatocytes
pour le foie et érythrocytes et leucocytes pour le sang). Fin mars 2015, une équipe de biologistes américains de l'Institut de technologie
du Massachussetts dirigée par Tyler Jacks et Daniel Anderson [1] ont réussi à guérir chez des souris
adultes une maladie génétique incurable du foie, la
« tyrosinémie ». Ils introduisirent dans les cellules
hépatocytaires un ARN guide spécifique ciblant trois gènes responsables de la
maladie, le gène codant l’endonucléase Cas 9 et un gène sain. Une fois dans la
cellule, l’ARN s’est associé à la protéineCas9. L’ensemble s’est, par la suite,
fixé sur les séquences cibles et a remplacé les gènes mutants par des gènes
sauvages. « Ces études sur des souris constituent les
premières preuves in vivo que
CRISPR-Cas9 est capable de corriger des maladies génétiques », commente
Tuan Huy Nguyen [4], biologiste
qui dirige un groupe de recherche en immunorégulation, transplantation et
thérapie génique. Cependant, cette expérience est peu efficace car il
est difficile de modifier la séquence
d’ADN de l’ensemble des hépatocytes constituants le foie du rongeur.
La technique
CRISPR/Cas 9 est tout de même plus efficace pour d’autres maladies génétiques,
notamment liées à des organes de petite taille, comme la drépanocytose. Il
s’agit d’une maladie héréditaire provoquée par
l’altération de l’hémoglobine, une protéine qui transporte l’oxygène dans le
sang. La technique CRISPR/Cas 9 est par ailleurs efficace pour guérir des
anémies comme la thalassémie. Cela consiste à réaliser des modifications
génétiques sur des prélèvements cellulaires de la moelle osseuse et à
réintroduire ces derniers chez le patient. Ce principe est également appliqué
sur des cellules germinales. Il s’agit de la thérapie génique préventive : elle empêche
l’héritage des gènes déficients par l’enfant.
Le système CRISPR/Cas 9 est-il applicable sur l'homme
? Avant d’arriver à ce stade, il y a certains aspects de l’outil qu’il faut
perfectionner. « Le point critique sera de confirmer que ce système n'induit
pas de lésions dans d'autres régions du génome », annonce Alain Fischer [4] chercheur en biologie français. On
doit également mettre en place de meilleurs systèmes d’introduction des ARN
guides dans les cellules afin d’optimiser la modification des gènes mutants
dans la majorité des cellules. La technique CRISPR/Cas9 présente, tout de même,
un grand potentiel dans la progression de la médecine. Des entreprises elles que
CRISPR Therapeutics cofondé par Emmanuelle CHARPENTIER [5] et Editas Medicine fondé
par Jennifer DOUDNA, continuent de faire des recherches approfondies afin de
guérir certaines maladies génétiques, pour lesquelles les traitements sont
encore peu développés.
Limites techniques
Même si elle est considérée comme
révolutionnaire, la technique CRISPR/Cas9 possède des limites. En effet, bien
que cette technologie soit plus efficace que les méthodes de mutagenèse
classique nécessitant l’action de nucléases, certaines complications ont été découvertes. Une des limites rencontrée peut être un effet hors site ou
« off-target » [6], c'est-à-dire que la nucléase Cas 9 qui est couplée à l’ARN guide
ne va pas agir sur le gène désirée. La mutation n’est alors pas
apportée sur le bon locus (un emplacement physique précis et invariable sur un
chromosome). Cette erreur de cible est due au fait que deux locus possèdent des
similitudes, sans être pour autant identiques. L'endroit
initialement ciblé ne sera donc pas muté. Ces emplacements semblables au site
ciblé doivent donc être identifié lors de la mise en place du système, ce qui
peut être difficile et peut parfois nécessiter une étude approfondie des
séquences de gènes.
Il est aussi possible
d'avoir un effet de" mosaïcisme" [7], c'est-à-dire que la
nucléase n'agit pas sur l'ADN au moment du développement embryonnaire où il n'y
a alors qu’une seule cellule. L'organisme ciblé possèdera donc certaines
cellules où la nucléase aura agi et apporté la modification et d’autres
cellules où elle n'aura pas agi. Si la modification avait été apportée sur
l’embryon possédant une cellule unique, toutes les cellules issues de sa mitose
auraient alors possédé la mutation.
De plus, une autre limite de cette
technologie est sa difficulté d'utilisation. En effet, cette technique peut
être longue à mettre en place et peu demander un travail qui peut s'étendre sur
plusieurs mois, nécessitant beaucoup de tests, ce qui demande donc de grands
investissements pour les laboratoires. La difficulté et le temps de mise en
place peuvent varier en fonction de la connaissance de l’organisme utilisé et
des séquences génétiques ciblés, ainsi que de leurs complexités. Ainsi, des
organismes complexes comme l'être humain et certaines de ses séquences
génomiques peu courantes vont donc demander plus de temps et de moyen de mise
en œuvre [8]. Enfin,
le développement de cette technologie peut être freinée par un coût élevé. Du fait
que cette technologie CRISPR/Cas9 soit encore en développement, son coût
d’utilisation n'est pas standardisé et est encore sujet à des changements.
Actuellement, le prix de la
mise en place de cette technique pour un gène peut varier entre 1000 et 1500€,
sans inclure le temps ou le personnel impliqué. Le prix reste donc bien
évidement un frein au développement et l’utilisation courante de cette
technique, qui est donc réservé aux laboratoires de recherche possédant des
fonds importants.
Limites éthiques
Les limites du système CRISPR/Cas 9 prennent une
nouvelle ampleur lorsqu’en 2015, l'équipe chinoise de Junjiu Huang, généticien
de l'université Sun Yat-sen, publia ses résultats d’étude sur des embryons
humains non viables, rouvrant alors le débat sur les problèmes d’éthiques que
soulève l’utilisation de ce système. En effet, un tabou a été transgressé :
celui du travail génétique sur l’être humain. D’une part, l’expérimentation sur
l’Homme est, dans nos sociétés, un sujet sensible et dont les points de vue
sont pour le moins divergents. D’autre part, les modifications du génome humain
sont, en accord aux lois n°2004-800 relatives à la bioéthique, soumises à des
réglementations très strictes qui autorisent ces mutations uniquement à des
fins thérapeutiques et si aucune modification n’est transmise à la descendance
du sujet. Cependant les études réalisées montrent que ce système peut
s’appliquer aux cellules différenciées d’un organisme (dans ce cas les
modifications ne sont pas transmises à la descendance) comme aux cellules
reproductrices : les gamètes, impliquant alors la transmission des mutations
effectuées sur l’embryon. Ceci soulève un important problème : plus qu’une
atteinte au patrimoine génétique d’un Homme, on touche ici au patrimoine
génétique de l’Humanité sans pour autant connaitre les répercutions à long
terme de ces modifications génomiques. En effet, comme nous avons pu le voir
précédemment, le système CRISPR/Cas 9 est sujet à des « off-target »,
c’est-à-dire des modifications sur une séquence non désirée mais qui lui
ressemble et qui entraineraient des mutations involontaires. Cette
non-spécificité pourrait alors être à l’origine de nouvelles pathologies
(issues de ces mutations non contrôlées) qui seraient transmises aux embryons via les gamètes. Nous n’avons
actuellement pas assez de recul sur cette innovation pour pouvoir prévoir les
effets à long terme et pourtant, on parle déjà d’essai sur des embryons humains
et peut être d’ici quelques années, sur l’Homme.
Enfin, le système CRISPR/Cas 9 n’est pas à l’abri de
dérives vers l’eugénisme et pourrait alors être utilisé à des fins moins
souhaitables que la thérapie génique. En effet, il reste plus simple d’utilisation que les techniques
classiques utilisant des nucléases. Si les possibilités avec CRISPR/Cas 9 sont
aussi étendues, pourquoi limiter son utilisation à la thérapie génique ? A
pouvoir modifier le génome des enfants à naitre (bien que l’utilisation
première soit pour éliminer une éventuelle maladie génétique), ne viendra-t-il
pas un moment où nous serons amenés à pouvoir choisir les caractéristiques
physiques de ces enfants à l’image d’un catalogue ? Cette utilisation, en plus
d’être en opposition aux principes éthiques qui portent sur l’Homme puisqu’elle
permettrait la sélection volontaire de gènes en, mettrait en péril la
biodiversité de l’espèce humaine. Bien que ces dérives puissent encore nous
sembler appartenir à un avenir lointain, les avancés du système CRIPSR/Cas 9
nous ouvrent dès à présent de nombreuses portes de la génétique humaine.
Il ravive de nouveau les débats portant
sur les lois éthiques qui vont devoir être rediscutées et adaptées aux récentes
découvertes d’ici les dix prochaines années.
Conclusion
Le système CRISPR/Cas 9 peut devenir une des
découvertes biotechnologies du siècle en terme d’outils de travail. Sa
simplicité d’utilisation, sa diversité d’application ainsi que son adaptation à
n’importe quel type cellulaire en font un véritable outil de « chirurgie
du génome ». Cependant nos connaissances limitées sur les effets
secondaires des modifications apportés le rendent actuellement difficile à
utiliser utilisable sur l’Homme. De même, pour une question d’éthique, le
travail sur le génome de l’être humain limitera probablement les applications
du système. Pour autant, le système CRISPR/ Cas 9, une fois complètement
déchiffré pourrait être la clef de maladies génétiques actuellement incurables.
Webographie
[1]Jean-Philippe Braly2015). Cité des sciences et de l’industrie : CRISPR-Cas9 : le couteau
suisse qui révolutionne la génétique. [page
consultée le 9/05/2016].http://www.cite-sciences.fr/fr/ressources/science-actualites/detail/news/crispr-cas9-le-couteau-suisse-qui-revolutionne-la-genetique/.
· [2]Merlin.
(2016). LE BLOG DE MERLIN: Boite de Pandore,
le choc CRISPR-Cas9: Aucune espèce ne lui résiste… !.[page consultée le
7/052016].http://homme-et-espace.over-blog.com/2016/01/boite-de-pandore-le-choc-crispr-cas9-aucune-espece-ne-lui-resiste.html
· [3]Académie Suisse des Sciences
Médicales. Actualites : Potentiel et enjeux de la chirurgie du
génome avec CRISPR/Cas9. [page consultée le 09/05/2015].www.samw.ch/dms/fr/Publications/Bulletins/15-4_SAMWbulletin_F.pdf.
· [4]Jean-Philippe
Braly. (2015). La Recherche L’Actualité
des sciences : La modification
de l'ADN à la portée de tous. [page consultée le 12/04/2016]. http://www.larecherche.fr/savoirs/palmares/technologie/
modification-adn-a-portee-tous-01-01-2015-197966.html.
· [5]Hervé Ratel. (2016). Sciences et avenir : CRISPR/Cas9 : la révolution de la chirurgie
du gène. [page consultée le 15/04/2016].http://www.sciencesetavenir.fr/sante/20160322.OBS6881/crispr-cas9-la-revolution-de-la-chirurgie-du-gene.html.
· [6]Robert
Sanders. (2015). Livescience: When
Is 'Gene Editing' Dangerous?. [page consultée le
22/04/2016].http://www.livescience.com/53015-when-is-gene-editing-dangerous.html.
· [7]Jim Yeadon. (2014).The Jackson laboratory: Pros and
cons of ZNFs, TALENs, and CRISPR/Cas9. [page consulté le 01/05/2016]. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2014/march/pros-and-cons-of-znfs-talens-and-crispr-cas.
· [8]F.
Ann Ran. (2013).PubMed Central:
Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. [page consultée le
22/04/2016]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3969860/.
Morgane
Heuclin-Reffait. (2015). Libération : Avec
«Crispr/Cas9», modifier un ADN devient presque aussi simple qu'un copier-coller. [page consultée le
12/04/2016].http://www.liberation.fr/sciences/2015/07/24/crisprcas9-une-methode-de-modification-genetique-a-la-fois-prometteuse-et-inquietante_1352779.
Florian Gouthière. (2015).Allodoteurs: Remplacer un gène par un autre: aussi simple que de prononcer "CRISPR/Cas9" (ou presque).[page consultée le 13/04/2016].http://www.francetvinfo.fr/sante/ue/remplacer-un-gene-par-un-autre-aussi-simple-que-de- prononce-crispr-cas9-ou-presque_1253665.html.
·
Frédéric
Courant (2015). Le site de la science et
de la découverte: la révolution des crispr. [page consultée le 05/05/2015].http://www.lespritsorcier.org/blogs-membres/la-revolution-des-crispr/.
· Pauline
Gravel. (2016). Le Devoir :
GÉNÉTIQUE Formidable CRISPR-Cas9. [page consultée le 15/04/2016].http://www.ledevoir.com/societe/science-et-technologie/461010/genetique-formidable-crispr-cas9.